실험 실전 시리즈 3편: Western blot의 본질 – 밴드보다 샘플링이 중요하다

1. 밴드는 결과가 아니라 ‘기록’이다

Western blot을 처음 배울 때, 대부분의 연구자는 “밴드가 잘 나왔는가”에 집중한다.
그러나 숙련된 연구자는 밴드보다 샘플의 상태를 먼저 본다.

Western blot은 단백질 발현을 보는 실험이 아니라,
세포나 조직이 어떤 상태였는지를 기록하는 기술이다.
즉, 밴드는 ‘결과’가 아니라 ‘세포의 생리학적 기록’이다.
그 기록을 얼마나 정확히 보존하느냐가 Western blot의 핵심이다.

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2. Lysis buffer는 “해부도구”다

세포를 lysis할 때 가장 많이 쓰는 문장이 있다.

“RIPA buffer로 단백질을 추출한다.”

하지만 여기서 중요한 건 어떤 buffer를 쓰느냐보다, 어떤 단백질을 보고 싶은가다.

Buffer 종류	특징	추천 용도
RIPA	강력한 detergent membrane/핵 단백질 추출 가능	전체 단백질 분석용
NP-40 / Triton-X100	비교적 mild, 세포막 파괴 최소화	signaling protein, cytosolic protein
Urea buffer	denaturing, 강력한 solubilization	insoluble protein, aggregation 분석
Lysis + protease/phosphatase inhibitor	단백질 분해 및 탈인산화 방지	phosphorylated protein, signaling 분석

즉, Western blot의 시작은 buffer 선택이다.
buffer는 단순한 용액이 아니라, 단백질 world를 해부하는 도구다.

때에 따라서 membrane 단백질과 cytocolic 단백질을 나누기 위해 2가지 buffer를 사용하는 경으로 있다.

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3. Protein quantification은 “양”보다 “정확성”

많은 연구자가 protein quantification을 “단백질을 얼만큼 넣느냐”의 문제로 본다.
그러나 Western blot에서 중요한 건 absolute 양이 아니라 sample 간의 일관성(consistency)이다.

예를 들어, loading 30 µg vs 20 µg은 큰 차이가 아닐 수 있지만,
cell number나 culture condition이 다르면 같은 양이라도 signal은 달라진다.
따라서 quantification은 “정확한 농도 측정”이 아니라 “동일 조건을 확보하는 통제 과정”이다.

💡 팁:
BCA assay를 사용할 때는 반드시 blank와 sample 간의 incubation time을 동일하게 맞추자.
시간차 1분이 band intensity 차이로 나타난다.

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4. Sample loading – 밴드의 시작은 여기서 끝난다

Western blot의 절반은 gel에 sample을 넣는 순간 결정된다.

• Loading volume은 각 well마다 ±1 µL 이내로 정확해야 한다.
• Sample buffer 비율은 4X buffer 1:3 비율이 가장 안정적이다.
• Denaturation은 95°C 5분보다 70°C 10분이 더 안정적인 경우도 많다.

💡 팁:

대부분의 단백질의 경우 heating으로 denaturation을 하지만, heating 조건이 오히려 단백질의 aggregation을 유발하기도 한다.

특히 GPCR과 같은 membrane protein을 다룰 때는 95°C에서 hydrophobic domain이 응집될 수 있으므로
저온 denaturation이 band를 깔끔하게 만든다.

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6. Transfer는 ‘과학’이 아니라 ‘균형’이다

많은 사람들이 transfer를 단순히 “단백질을 옮기는 과정”으로 본다.
하지만 이는 열, 전류, 막의 특성, buffer 조성의 균형 실험이다.

• Transfer 시간/전류: 100V, 90분 (mini gel 기준)이 표준이지만,
  → high MW protein(>100 kDa)은 low voltage로 오래 (60V, 3시간)
  → low MW protein(<20 kDa)은 short time transfer (120V, 60분)
• Membrane 종류: PVDF는 hydrophobic, signal 강하나 background 높음 / Nitrocellulose는 균일하지만 약함

즉, transfer 조건은 “표준값”이 아니라 단백질의 성격에 따라 조절해야 하는 변수다.

특히 최근에는 기술의 발달로 wet type transfer 뿐만 아니라 semi-dry 형식의 transfer 기기도 다양하다.

때에 따라서 semi-dry transfer의 경우 detection이 안되는 문제가 있기도하니 주의!

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6. Antibody는 ‘도구’가 아니라 ‘번역자’다

Western blot의 신뢰도는 antibody에 달려 있다.
하지만 antibody는 단백질의 존재를 ‘보여주는’ 것이 아니라,
그 단백질의 ‘상태’를 번역해주는 언어 번역자다.

예를 들어,

• phospho-antibody는 sample handling이 조금만 늦어도 신호를 잃는다.
• isoform-specific antibody는 cross-reactivity를 막기 위해 blocking condition을 정밀히 맞춰야 한다.

💡 팁:
항체를 신뢰하려면, 논문 3편 이상에서 같은 clone이 동일한 결과를 보였는지 확인하라.
lot마다 성능이 달라질 수 있다.

항체의 보관 조건은 회사마다 다르다. -20도 보관시 얼게 되는 경우 freeze-thaw cycle이 많을 수록 activity가 떨어질 수 있으니 분주해 놓을 것!

때에 따라 항체를 분주하지 말라는 문구가 있는 경우도 있으니 manual은 꼼꼼히 확인!

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7. Band intensity는 진실이 아니다

Western blot은 semi-quantitative 실험이다.
즉, “밴드가 진하다”는 건 단백질이 많다는 뜻이 아니라
항체 결합 효율, ECL 노출 시간, membrane 상태의 종합 결과다.

그래서 Western blot의 결과는 ‘진실’이 아니라 ‘표현’이다.
이 표현을 정량화하려면, loading control (GAPDH, β-actin, Tubulin 등)을
실험 조건에 맞게 검증해야 한다.

특히, 처리 조건에 따라 housekeeping gene 발현이 변할 수 있으므로
“항상 GAPDH”라는 고정관념은 위험하다.

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8. 마치며 – Western blot은 밴드 예술이 아니다

Western blot은 단백질의 존재를 “보여주는” 실험이 아니라,
세포의 반응을 해석하는 언어학적 작업이다.
밴드가 아니라, 샘플의 준비와 조건이 진짜 실험의 본질을 결정한다.

좋은 Western blot은 노이즈가 없는 밴드가 아니라,
변수를 통제하고 원리를 이해한 밴드다.

“Western blot은 데이터를 주지 않는다.
대신, 세포가 어떤 상태였는지를 조용히 들려준다.”

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✍️ 연구자의 메모

“밴드가 잘 나오는 사람은 손이 빠른 사람이고,
밴드를 이해하는 사람은 생각이 깊은 사람이다.”